Autori: 1Vizza Donatella, 1Perri Anna, 1Toteda D, 1Lupinacci S, 2Perrotta I, 1La Russa A, 1Lofaro D, 1Leone F, 1Gigliotti P, 1Bonofiglio R.
Affiliazioni: 1Centro di Ricerca “Rene e Trapianto” – UOC Nefrologia e Dialisi abilitata al Trapianto, AO Cosenza; 2Dipartimento di Biologia, Ecologia e Scienze della Terra – DiBEST , Università della Calabria, Cosenza.
INTRODUZIONE: Diverse evidenze sperimentali in vitro e in vivo dimostrano che l’autofagia esercita un ruolo cruciale nel mantenimento dell’omeostasi renale e rappresenta un meccanismo protettivo nel danno acuto e cronico. Precedenti studi hanno dimostrato che in cellule del tubulo prossimale il trattamento con l’inibitore di mTor, Rapamicina(R), attivando la via autofagica, mitiga il danno apoptotico indotto da proteinuria. Tuttavia, il meccanismo molecolare alla base di tale effetto non è stato ancora individuato.
METODOLOGIA: Cellule del tubulo prossimale renale HK2, western blotting (WB), Real-time PCR, DNA laddering, silenziamento genico , trasfezione transiente, mutagenesi sito specifica, saggi di vitalità cellulare, microscopia elettronica (TEM), immunoprecipitazione della cromatina (ChIP).
RISULTATI: Nelle cellule HK2, l’esposizione breve a basse dosi di R (7 ng/ml) innesca il flusso autofagico attraverso la transattivazione del promotore del p75NTR, recettore di membrana che media, in maniera cellulo-specifica, sopravvivenza o apoptosi NGF-indotti (Fig.1). I dati ottenuti mostrano che nelle HK2 nelle quali abbiamo silenziato in maniera transiente il gene che codifica per p75NTR , l’autofagia R-indotta è abrogata, poiché l’up-regolazione di Beclin-1 ed LC3 risulta reversata (Fig.2). In tale condizioni sperimentali, la TEM non evidenziava la presenza di vacuoli autofagici la cui presenza era invece rilevata in cellule non p75NTR -silenziate (Fig.3). Studi di trasfezione transiente, realizzati utilizzando costrutti wild-type e deleti del p75NTR ,hanno dimostrato il coinvolgimento del fattore di trascrizione Early growth response protein 1 (EGR1) quale mediatore dell’autofagia R-indotta, poiché il trattamento con R ne promuove la traslocazione nucleare, evento non osservato per altri fattori di trascrizione i cui siti responsivi sono presenti sul promoter di p75NTR (Fig.4). Inoltre, le cellule HK2 sono state esposte a dosi elevate di albumina umana (AU 8mg/ml) per mimare il danno proteinurico in vitro. I dati ottenuti hanno mostrato una maggiore up-regolazione di p75NTR e dei markers autofagici in cellule co-trattate con AU+R, rispetto a quelle esposte alla sola R (Fig.5). Il pathway attraverso cui il p75NTR regola gli eventi autofagici coinvolge la via delle MAPK che risulta attivata in presenza di R, soprattutto in cellule co-trattate, effetto nettamente reversato in presenza dell’inibitore di tale via PD98059 (Fig.6). Esperimenti di ChIP hanno chiarito il meccanismo molecolare attraverso cui la R innesca autofagia p75NTR -mediata sottolineando un aumentato reclutamento del fattore di trascrizione EGR1 e della Polimerasi II sulla regione EGR1 responsiva localizzata all’interno del promoter di p75NTR. E’ ben noto che il legame di EGR1 sul promoter del gene target LC3 ne aumenta la trascrizione; tale aumento è stato confermato anche nelle HK2 trattate con R+AU mentre risulta reversato in presenza di un noto inibitore dell’EGR1 (Fig.7). Infine, abbiamo confermato che l’autofagia persiste nel tempo per proteggere il tubulo prossimale dal danno proteinurico, poiché sotto trattamento cronico con R da sola o in combinazione con AU, abbiamo osservato una permanete upregolazione proteica di beclin 1 non accompagnata da eventi apoptotici come evidenzia il mancato clivaggio della proteina PARP (Fig.8).
CONCLUSIONI: I nostri dati dimostrano, per la prima volta, che nelle cellule del tubulo renale, l’autofagia p75NTR-mediata, indotta da basse dosi di rapamicina, protegge dal danno proteinurico. Studi futuri in vivo sono necessari per investigare se l’uso di basse dosi di inibitori di mTor, attraverso l’attivazione dell’autofagia, potrebbe rappresentare come nuova strategia terapeutica, nel danno proteinurico .
Bibliografia: