Autori: F. Prosperi 1, V. Costanzo 2, A. Iervolino 2, F. Petrillo 1, L. De La Motte 1, P. Marzuillo 1, S. Jelen 2, A. La Manna 1, F. Trepiccione 1, G. Capasso 1,2
Affiliazioni: (1) Nefrologia, Università degli studi della Campania “Luigi Vanvitelli”, (2) Biogem scarl Ariano irpino, (3) Pediatria, Università degli studi della Campania “Luigi Vanvitelli”
Razionale
Il diabete insipido nefrogenico (NDI) è una malattia genetica rara caratterizzata dall’incapacità di concentrare l’urina. L’ NDI si verifica quando il dotto collettore del nefrone non risponde all’azione antidiuretica della vasopressina (AVP). La mancanza di risposta all’ AVP è causata principalmente da mutazioni nel recettore AVPR2 (vasopressina) nell’uomo. Le mutazioni nel gene umano AVPR2 causano il 90% di tutti i NDI e sono ereditati in forma X-linked; mutazioni nel gene dell’AQP2 determinano il restante 10% dei casi e sono ereditati in forma autosomica. Ad oggi sono state riportate più di 200 mutazioni differenti del gene AVPR2, la maggior parte delle quali sono mutazioni missenso. Queste mutazioni sono state suddivise in 5 classi diverse secondo il meccanismo con cui il recettore mutante viene compromesso. Abbiamo individuato nei pazienti quattro nuove mutazioni del recettore AVPR2 associate a grave NDI. Questo studio mira alla caratterizzazione funzionale di queste mutazioni per definire la loro patogenesi e in seguito identificare potenziali chaperones in grado di restituire la proteina funzionale.
Materiali e Metodi:
Tramite mutagenesi sito-specifica, le quattro mutazioni sono state introdotte nel vettore hV2R-GFP WT. I plasmidi contenenti le differenti mutazioni del V2R sono state stabilmente immesse nelle cellule MDCK ed i singoli cloni sono stati sottoposti a screening per fluorescenza. Per l’immunocitochimica, le cellule sono state cresciute su filtri Costar fino a raggiungere lo stato di polarizzazione e il recettore identificato mediante fluorescenza con GFP. Per gli studi di co-localizzazione intracellulare è stato utilizzato un anticorpo anti-calnexina, come marcatore del reticolo endoplasmatico. La risposta alla vasopressina infine ha valutato sia la capacità di internalizzazione indotta dal legame dDAVP-V2R, sia dalle variazioni di cAMP citosolico.
Risultati:
Tre su quattro mutazioni identificate nei nostri pazienti, causano malattia per ritenzione citosolica del V2R. Queste proteine sono per lo più ritenute nel reticolo endoplasmatico (ER) sotto forma di proteina immatura. In effetti, queste proteine mutate presentano una vita media relativamente più breve rispetto alla forma WT, come testato con saggio di cicloesamide. Una mutazione invece è propriamente espressa a livello della membrana basolaterale come per la proteina wild type, non mostrando alcun problema di sorting plasmacellulare. Tuttavia, questa mutazione rende resistente al dDAVP il recettore V2R. Infatti, la somministrazione di dDAVP nelle cellule portatrici della mutazione non induce l’internalizzazione del recettore, cosi come invece avviene nelle cellule wt-MDCK polarizzate. Anche quest’ultima mutazione come per tutte le altre non espresse in membrana, non induce un incremento del cAMP dopo stimolazione con dDAVP.
Conclusioni
Abbiamo caratterizzato quattro nuove mutazioni che nei pazienti sono associate a grave NDI, identificandone per ognuna la classe di appartenenza. Lo studio è in corso per testare farmaci in grado di migliorare la risposta di questi recettori mutati al dDAVP. A questa fase sperimentale seguirà l’applicazione nel paziente secondo un approccio di “precision medicine”.
Bibliografia: