Autori: 1Lupinacci Simona, 1Perri Anna,1Toteda G, 1Vizza D, 2Puoci F, 2Parisi OI, 1La Russa A, 1Lofaro D, 2Giordano F, 1Bonofiglio M, 1Leone F, 1Gigliotti P, 1Bonofiglio R
Affiliazioni: 1Centro di Ricerca “Rene e Trapianto” – UOC Nefrologia e Dialisi abilitata al Trapianto, AO Cosenza; 2Dipartimento di Farmacia e Scienze della Salute e della Nutrizione, Università della Calabria, Cosenza.
INTRODUZIONE:
Le cellule mesoteliali (MC) svolgono un ruolo attivo nella alterazione morfo-funzionale a cui va incontro la membrana peritoneale durante il trattamento dialitico peritoneale (PD). Subito dopo l’inizio della PD, le MC mostrano una perdita progressiva del fenotipo epiteliale acquisendo, attraverso un processo di transizione mesotelio-mesenchimale (MMT), caratteristiche mio-fibroblasto-simili. Tali cellule invadendo lo stroma sottomesoteliale contribuiscono alla fibrosi peritoneale e all’angiogenesi, responsabili della perdita della funzione della membrana peritoneale. In tale scenario il principale fattore pro-fibrotico è rappresentato dal TGFβ-1 che, attraverso il cross-talk tra le sue due vie di segnale intracellulare, via canonica e via non-canonica, promuove fibrosi. Nostri studi recenti, in vitro ed in vivo, hanno dimostrato che i polifenoli dell’olio d’oliva mitigano il processo di MMT. Lo scopo del seguente lavoro è stato quello di investigare in vitro i meccanismi molecolari attraverso i quali i polifenoli promuovono l’effetto biologico osservato. A tale scopo cellule mesoteliali umane immortalizzate (Met5A) sono state trattate, per 6 giorni, con TGFβ-1- da solo e in combinazione con un estratto polifenolico ottenuto dalle foglie dell’ulivo (EP), il cui contenuto polifenolico è superiore a quello del frutto.
METODOLOGIA: MTT-assay; western blot (WB); real-time-PCR; wound-healing scratch and trans-well migration assays, trasfezione transiente.
RISULTATI: Attraverso saggi di vitalità cellulare abbiamo stabilito la dose minima efficace di EP da utilizzare nello studio (25µg/ml) (Fig.1). Saggi di WB hanno dimostrato che il co-trattamento TGFβ-1+EP riduce l’espressione proteica dei marcatori mesenchimali (N-cadherin, Alpha-sma, Fibronectin) e delle principali metalloproteasi (MMPs) TGFβ-1-indotta (Fig.2A-B) con contestuale up-regolazione del marcatore epiteliale E-Cadherin la cui down-regolazione genica e proteica era osservata sotto trattamento con solo TGFβ-1 (Fig.6A-B). Saggi di migrazione cellulare hanno evidenziato che il co-trattamento TGFβ-1+EP determina una marcata riduzione della capacità migratoria delle MC TGFβ-1-indotta (Fig.3). Inoltre, attraverso saggi di WB effettuati su estratti proteici nucleari, citosolici e totali, abbiamo osservato che EP riduce la traslocazione nucleare delle SMAD (via canonica del TGFβ-1) e la fosforilazione delle pMAPK, pP38 e pJNK (via non canonica del TGFβ-1) osservata in cellule trattate con TGFβ-1 (Fig.4-5). In maniera interessante i nostri risultati hanno mostrato che il co-trattamento determina anche una significativa riduzione del contenuto nucleare di SNAIL TGFβ-1-indotto, che rappresenta, insieme al complesso SMAD3/SMAD4, il principale co-repressore del promoter dell’E-cadherin. Infine, attraverso saggi di trasfezione transiente effettuati utilizzando un costrutto contenente il promoter wild-type dell’E-cadherin, abbiamo dimostrato che EP determina un aumento dell’attività trascrizionale del suddetto promoter (Fig.6C,D,E).
CONCLUSIONI: I nostri dati dimostrano che EP mitiga il processo di MMT TGFβ-1-indotto, poiché, riduce l’espressione dei marcatori mesenchimali e, attraverso l’inibizione del signaling del TGFβ-1, riduce in maniera significativa la traslocazione nucleare del co-repressore SNAIL del promoter dell’E-cadherin, aumentando l’espressione del marcatore epiteliale. Tali risultati preliminari aprono nuovi scenari sul potenziale utilizzo dei polifenoli nel trattamento dialitico peritoneale al fine di contrastare il processo di MMT sin dall’inizio del trattamento.
Bibliografia: