Autori: 1Toteda Giuseppina, 1Perri Anna, 1Vizza D, 1Lupinacci S, 2Puoci F, 2Parisi OI, 1La Russa A, 1Lofaro D, 1Bonofiglio M 1Leone F, 1Gigliotti P, 1Bonofiglio R.
Affiliazioni: 1Centro di Ricerca Rene e Trapianto, UOC Nefrologia e Dialisi abilitata al Trapianto, AO Cosenza; 2Dipartimento di Farmacia e Scienze della Salute e della Nutrizione, Università della Calabria, Cosenza.
INTRODUZIONE: La malattia policistica autosomica dominante (ADPKD) è causata da mutazioni nei geni codificanti per la Policistina 1 (PKD1) e/o Policistina 2 (PKD2),coinvolte nel mantenimento della polarità della cellula tubulare, secrezione e riassorbimento tubulare. La perdita della polarità cellulare promuove il processo di cistogenesi renale che, nel 50% dei casi, conduce ad ESRD. I Vaptani, a fronte dei marcati effetti poliurici, ad oggi rappresentano l’unico farmaco in grado di rallentare la progressione del danno. Recentemente, grande attenzione è rivolta al potere anti-proliferativo dei polifenoli, prevalentemente in ambito oncologico. Poiché i meccanismi molecolari implicati nella cistogenesi presentano analogie biologiche con il processo neoplastico, scopo di questo lavoro è stato quello di testare, in sistema in vitro di rene policistico, gli effetti di un estratto polifenolico ottenuto dalle foglie dell’ulivo (OLE) sull’accrescimento e/o regressione volumetrica delle cisti renali.
METODOLOGIA: Cellule immortalizzate con mutazione nota del gene PKD1 (WT 9-12 ATCC); cellule normali del tubulo prossimale HK2; MTT assay; western blotting (WB); Real Time PCR; DNA Laddering; colture cellulari tridimensionali; trasfezione transientE.
RISULTATI: Dalla valutazione della velocità di crescita delle WT 9-12 rispetto alle HK2 emerge che il numero di cellule raddoppia dopo 48h nelle WT 9-12 confermando che tale mutazione conferisce loro una maggiore velocità di crescita rispetto alle HK2 già in condizioni basali. Per testare gli effetti dell’OLE sono stati eseguiti saggi di vitalità cellulare con dosi crescenti dell’estratto a diversi tempi. Individuata la dose minima efficace (IC50) abbiamo eseguito delle indagini quantitative per investigare la capacità dell’OLE di influenzare l’espressione di proteine coinvolte nella regolazione del ciclo cellulare. I nostri risultati hanno evidenziato che il trattamento cronico (72 h) con OLE promuove una riduzione dose-dipendente della vitalità cellulare, con down-regolazione, genica e proteica, della Ciclina-D1. Inoltre, OLE determina una up-regolazione dell’inibitore del ciclo cellulare p21, una delle proteine finemente regolate dal complesso PC1/PC2. Saggi di trasfezione transiente, effettuati attraverso l’utilizzo di costrutti contenenti il promoter wild-type di p21 e suoi deleti, hanno evidenziato che OLE causa una importante attivazione trascrizionale del promoter di p21 con conseguente blocco del ciclo cellulare. E’ ben noto che il cAMP gioca un ruolo centrale nella cistogenesi. Infatti mentre arresta la proliferazione delle cellule tubulari normali attraverso l’inibizione dell’asse B-Raf-MEK-ERK akt-mediata, nell’ADPKD tale inibizione viene meno con conseguente aumento della proliferazione. Dai nostri risultati di WB emerge che l’OLE aumenta la fosforilazione di akt che a sua volta inattiva B-Raf con conseguente down-regolazione della via delle MAPK e quindi della proliferazione cellulare. Nell’ADPKD l’apoptosi è persistentemente anomala e può distruggere gran parte del normale parenchima renale, permettendo così all’epitelio cistico di proliferare. Saggi di WB hanno evidenziato che OLE è in grado di up-regolare l’espressione proteica di markers anti-apoptotici quali Bcl2 mentre down-regola le proteine pro-apoptotiche p53 e BAD. La riduzione del processo apoptotico è stata confermata dal test di DNA laddering e dal ridotto clivaggio della proteina PARP.
Infine, abbiamo testato l’effetto di OLE su cisti in 3D ottenute da cellule WT9-12 piastrate in matrigel. Il calcolo del volume delle cisti trattate per sei giorni con OLE ha evidenziato che il trattamento determina una significativa riduzione della crescita delle cisti e regressione delle stesse (-30%).
CONCLUSIONI: I nostri risultati suggeriscono che gli estratti polifenolici presenti nelle foglie di ulivo potrebbero rappresentare una nuova terapia coadiuvante nella cura della malattia policistica renale.
Bibliografia: