Razionale
Le cellule progenitrici endoteliali (EPC) sono precursori di origine midollare note per limitare il danno renale acuto (AKI) mediante fattori paracrini quali le microvescicole (MV), particelle coinvolte nella comunicazione intercellulare tramite transfer di proteine e di RNA. L’attivazione della cascata del complemento è nota mediare il danno renale da ischemia-riperfusione (IRI). Scopo: valutare il ruolo protettivo di EPC MV in IRI renale grazie all’inibizione del complemento indotta da transfer di specifici RNAs codificanti per fattore H (CFH), CD55/DAF e CD59.
Metodi
Isolamento EPC da sangue periferico e caratterizzazione MV dopo ultracentrifugazione per contenuto proteico/RNA. Valutazione effetti MV in un modello di IRI nel ratto e in vitro su cellule endoteliali peritubulari e cellule epiteliali tubulari renali umane coltivate in ipossia.
Risultati
Le EPC MV hanno dimensione di 60-130 nm (Fig. 1A-D), esprimono diverse proteine in superficie (Fig.1E) e trasportano microRNA/mRNA (Fig. 1F-G) che modulano proliferazione cellulare e apoptosi tra cui gli inibitori del complemento CFH, CD55/DAF e CD59 (Fig. 1H-M). Nel modello di IRI renale nel ratto, le MV si localizzano nei capillari peritubulari e nei tubuli inducendo protezione funzionale (Fig. 2A-B) e morfologica (Fig.2C) da AKI mediante riduzione dell’apoptosi e dell’infiltrazione leucocitaria (Fig. 2D). Le MV riducono la deposizione di C5b-9/MAC (Fig. 3A-B), C3 (Fig. 3C-D), e aumentano l’espressione di CD55/DAF(Fig.4A-B), CD59 (Fig.4C-D) e CFH (Fig. 4E-F) nel rene ischemico. L’effetto renoprotettivo delle MV risulta ridotto dal trattamento con RNasi (Fig. 2-4). In vitro, le MV vengono internalizzate da cellule endoteliali peritubulari renali (Fig. 5A), riducono l’apoptosi indotta da ipossia (FIg. 5B) inducendo l’espressione di CFH, CD55/DAF e CD59 in modo RNA-dipendente sia a livello trascrizionale (Fig.5C-E) sia a livello della traduzione proteinca (non mostrato). Le MV sembrano ridurre il deposito di C5b-9 e C3 sulle cellule endoteliali ipossiche (Fig. 5F-G). Simili risultati sono stati osservati dopo internalizzazione delle MV in cellule tubulari umane (Fig. 6A) con diminuzione dell’apoptosi (Fig. 6B), aumento dell’espressione di mRNA codificanti per CD55/DAF, CD59 e CFH (Fig. 6C-E) e riduzione del deposito di C5b-9 e C3 (Fig. 6F-G). Gli effetti anti-apoptotici e di inibizione del complemento non venivano osservati quando le MV venivano trattate con RNasi o usando MV rilasciate da EPC transfettate con specifici siRNA volti a silenziare CFH, CD55/DAF e CD59 (Fig. 5-6).
Conclusioni
EPC MV proteggono da AKI in seguito a IRI inibendo l’attivazione della cascata del complemento mediante transfer di mRNA codificanti per gli inibitori specifici CFH, CD55/DAF e CD59 nelle cellule endoteliali peritubulari e cellule epiteliali tubulari renali danneggiate.
