RAZIONALE
Livelli elevati di citochine pro-infiammatorie ed aumento dello stress ossidativo sono implicati nello sviluppo dell’anemia, condizione caratterizzante la malattia renale cronica (Barany P – 2003) [1], (Gunnell J – 1999) [2], (Kimmell PL – 1998) [3] (full text). Molti Autori suggeriscono come tutto questo possa essere mediato da citochine pro-infiammatorie quali l’interleuchina (IL) 6, il tumor necrosis factor-alpha (TNF-α), l’interferone gamma (IFNγ), che determinerebbero una potente soppressione dell’eritropoiesi (Means RT Jr – 1996) [4], (Dai CH – 1998) [5] (full text). A partire dai primi anni Novanta, sono stati introdotti nella pratica clinica gli agenti stimolanti l’eritropoiesi (Erythropoiesis Stimulating Agents, ESA) con notevole miglioramento della qualità di vita e dell’outcome clinico del paziente affetto da insufficienza renale cronica (IRC). Tuttavia, sin dalle prime osservazioni, è risultato evidente come vi sia un’enorme variabilità nella risposta al farmaco, sia nel tempo nello stesso paziente, sia tra un paziente e l’altro, e come i consumi di ESA siano in gran parte ascrivibili all’uso di dosi molto elevate in un gruppo relativamente piccolo di soggetti che non rispondono adeguatamente. Il Nostro studio si è quindi basato sulla stretta correlazione, ampiamente valutata e validata dalla letteratura, vigente tra la malattia renale cronica e lo stato infiammatorio, quest’ultimo identificato da diversi markers dell’infiammazione tra i quali spicca sicuramente il TNF-α (Stenvinkel P – 2001) [6], (Macdougall IC – 2002) [7] (full text), (Bergstrӧm J – 2000) [8]. Abbiamo pertanto utilizzato colture cellulari primarie (PBMC) perché fonte dei principali mediatori dell’infiammazione nonché per la presenza, a livello di membrana, dei recettori per l’eritropoietina, ed abbiamo valutato l’azione dell’EPO sull’espressione genica di questa linea cellulare previa stimolazione con TNF-α. In ultima analisi, abbiamo focalizzato la nostra attenzione sulla comparazione dell’azione della eritropoietina α umana ricombinante purificata (recEPO-α) e della sua forma commerciale in relazione ai target molecolari rilevati.
CASISTICA E METODI
Colture di PBMC sono state trattate con recEPO-α e/o TNF-α. Esperimenti di microarray hanno confrontato: cellule di controllo (1) vs cellule stimolate con TNF-α, (2) vs cellule trattate con recEPO-α, (3) vs cellule trattate con entrambi gli stimoli. Le valutazioni quantitative sono state effettuate in Real-Time PCR. L’interleukina (IL) 1β è stata misurata in ELISA. Le variazioni nell’espressione genica sono state normalizzate, e la significatività statistica è stata calcolata utilizzando l’analisi “multiclass” del software Significance Analysis of Microarray (SAM). I valori mancanti sono stati calcolati utilizzando il K-algoritmo più vicino settato a 100. Il “False Discovery Rate” (FDR) = 0% è stato utilizzato per l’analisi “multiclass”.
RISULTATI
Dall’analisi “Multiclass” (Figura 1) abbiamo ottenuto una lista di 124 geni modulati significativamente tra le tre classi analizzate. Poiché il nostro proposito è di evidenziare meccanismi molecolari potenzialmente coinvolti nella EPO-resistenza in una condizione infiammatoria riprodotta in vitro, abbiamo valutato i principali pathways associati con la lista genica, sovrapponendovi quelli strettamente in relazione con la risposta immunitaria e l’azione dei mediatori dell’infiammazione. L’analisi ha evidenziato differenze nell’espressione genica principalmente per il signaling dell’IL-1 (p < 0.01) (Figura 2). L’analisi in Real-Time conferma la down-regulation esercitata dalla recEpo-α sui PBMC attivati con TNF-α per i geni codificanti l’IL-8 ed il suo recettore CXCR2, molecole ad azione pro-infiammatoria. L’azione sinergica causa una up-regulation per i geni dell’IL-1 (isoforme α e β) e le chemochine CXCL1, CXCL5 e CCL8. Per tutti i geni analizzati non si riscontrano differenze significative tra la stimolazione con recEPO-α o la sua forma commerciale, suggerendo che tali targets vengono modulati in PBMC attivati indifferentemente da entrambe le forme (Figura 3). Nel nostro modello sperimentale, dall’analisi in microarray non sono state evidenziate differenze significative per l’IL-1β, citochina i cui livelli elevati sono stati correlati in precedenza con EPO-resistenza. Poiché tale citochina è espressa a livello trascrizionale sotto forma di precursore, e solo la forma clivata è attiva e secreta, abbiamo effettuato misurazioni in ELISA per l’IL-1β, comparando il rilascio nei medium condizionati dei PBMC trattati con TNF-α e/o recEPO-α ed EPO-α. I risultati (fig. 4) mostrano per l’IL-1β un incremento significativo dopo stimolazione con TNF-α e un’induzione maggiore se le cellule trattate con TNF-α vengono stimolate con recEPO-α od Epoetina-α. Diversamente da quanto evidenziato dall’analisi quantitativa dell’espressione, le cellule trattate con la sola EPO, mostrano livelli più bassi rispetto alle cellule di controllo, suggerendo la presenza di un meccanismo d’inibizione nella formazione della forma attiva, clivata, ed a seguire secreta, della IL-1β.
CONCLUSIONI
Il nostro studio è stato costruito sperimentalmente tenendo in considerazione i dati attualmente disponibili in letteratura circa la relazione tra infiammazione ed EPO resistenza. Questa sembra essere imputabile a diversi fattori co-interagenti: alterato rapporto tra citochine stimolatrici e inibitrici l’eritropoiesi, interazioni a livello recettoriale ed interferenza con i segnali intracellulari post-recettoriali tra citochine pro-infiammatorie ed ESA (van der Putten K – 2008) [9]. Nel Nostro studio abbiamo valutato le principali differenze nell’espressione genica su PBMC ottenuti da soggetti sani, stimolati con recEPO-α umana ricombinante, in presenza o assenza di uno stimolo pro-infiammatorio (TNF-α), principalmente al fine di evidenziare, in termini di modulazione dell’espressione genica, le risultanti delle interazioni tra stimoli antagonisti. Utilizzando condizioni statistiche astringenti, al fine di minimizzare la variabilità individuale, oltre 100 geni risultano differentemente espressi attraverso le nostre classi di analisi. Tali geni svolgono un ruolo in funzioni specifiche dell’immunità, quali la migrazione e le interazioni cellula-cellula, suggerendo che, almeno in vitro, la stimolazione con epoetina α scaturisca effetti diversi a seconda che le cellule bianche siano attivate o meno da uno stimolo pro-infiammatorio. Gli effetti sinergici riscontrati per epoetina-α e TNF-α mostrano dunque, l’up-regulation di geni strettamente legati alla promozione del processo infiammatorio, delineando un plausibile scenario in vivo, in cui la correlazione positiva evidenziata tra EPO-resistenza e livelli elevati di alcuni mediatori pro-infiammatori, sia parzialmente dovuta al trattamento con gli ESA stessi. D’altra parte, i dati raccolti evidenziano anche una modulazione negativa per molecole importanti nelle fasi iniziali e nel prosieguo della flogosi, su tutti l’IL-8 e il suo recettore di tipo B. Obiettivo futuro sarà la misurazione in vivo dei target molecolari evidenziati, in pazienti ipo- e responsivi al trattamento con ESA, onde evidenziare meccanismi regolatori trascrizionali aggiuntivi (es. polimorfismi, meccanismi epigenetici) inter-individuali nell’EPO-resistenza.
