RUOLO DEI POLIMORFISMI GENETICI DI KLOTHO NELLA SODIO-SENSIBILITÀ: LINK TRA SODIO ED INVECCHIAMENTO

Razionale

Numerosi studi sull’animale sperimentale e nell’uomo (Xiao [1] )hanno dimostrato che i livelli circolanti di Klotho diminuiscono con l’età dopo i 40 anni. Numerosi studi nel topo transgenico (KL eterozigosi) hanno dimostrato che la deficienza parziale del gene di Klotho causa invecchiamento precoce. Nello stesso ceppo di topi transgenici (Zhou 2015 [2]) è stato recentemente dimostrato un progressivo sviluppo di ipertensione arteriosa, soprattutto se esposti a dieta ipersodica (ipertensione sodio sensibile). (Figura 1)

Un recente studio di espressione genica inoltre ha confermato che Klotho si esprime nel rene nel tubulo convoluto distale. (Lee 2015 [3])

La sodio sensibilità intesa come necessità di aumentare i valori pressori per eliminare un carico di sale è presente nel 40-50% degli ipertesi adulti, mentre arriva all’80 % dei soggetti ipertesi anziani.

Scopo dello studio è quindi indagare il ruolo dei livelli circolanti di Klotho e dei polimorfosmi del gene Klotho nel determinare la sodio-sensibilità nell’ipertensione arteriosa nell’uomo.

Disegno dello studio

Abbiamo analizzato tre differenti casistiche di pazienti ipertesi essenziali;

1. Risposta al test di carico salino acuto in 668 pazienti ipertesi, mai trattati farmacologicamente, naive attraverso carico salino acuto (NaLoad: 310 mMol in 2 h ev). Si definiscono sodio-sensibili (SS) i pazienti che presentano aumento della pressione arteriosa media> 4 mmHg al termine della infusione, sodio resistenti (SR) quelli che non la modificano.

2. Follow-up ambulatoriale in 370 pazienti ipertesi essenziali di prima diagnosi

3. Risposta a dieta a basso contenuto di sodio (<100 mEq/die per 15 gg) in 140 pazienti ipertesi, mai trattati farmacologicamente.

Tutti i pazienti hanno firmato il consenso informato.

Identificazione dello SNP candidato nel gene Klotho

Attraverso analisi GWA abbiamo identificato 42 SNP nel gene Klotho (che si riducono a 15 con la strategia tagging 0,80). L’analisi di Linkage Disequilibrium (LD) dei dati HapMap ci ha permesso di identificare una mutazione G/T missense con MAF 0,17 nell’esone 2. Tutte le analisi successive sono quindi state eseguite utilizzando questo SNP (KL G/T). (figura 6)

Risultati: carico salino acuto

Le caratteristiche cliniche basali dei pazienti sottoposti al test di carico salino acuto sono riportate nella tabella:

I pazienti portatori dell’allele G dello SNP G/T di Klotho sono più rappresentati nel gruppo dei sodio sensibili e presentano una curva pressione natriuresi più ripida. (figura 2)

I pazienti sodio sensibili presentano anche livelli di Klotho significativamente più bassi rispetto ai sodio-resistenti. (figura 3). La relazione inversa tra livelli di Klotho e creatinina plasmatica conferma il ruolo di Klotho nell’invecchiamento precoce del rene.

Risultati: follow up

Lo studio di Follow-up ha incluso 371 pazienti ipertesi essenziali afferenti al nostro ambulatorio, con le seguenti caratteristiche al reclutamento:

• età <55 anni alla prima visita.
• No terapia anti-IPT alla prima visita.
• Visite Annuali di follow-up.
• Target BP come da ESH guidelines.

La tabella riassume i dati clinici al momento della prima visita:

I pazienti portatori dell’allele G presentano un più precoce deterioramento della funzione renale nel tempo, pur rimanendo nell’ambito della normofunzione. (figura 4)

Risultati: dieta a basso contenuto di sodio

La compliance alla dieta a basso contenuto di sodio (aderenza monitorata con sodiuria 24; target sodiuria 24h <100 mEq/24 h o riduzione >40% rispetto al basale) è stata di circa il 35% dei pazienti reclutati ottenendo un campione finale di 140 pazienti.

La tabella riassume i dati clinici dei 140 pazienti complianti alla restrizione sodica:

Lo SNP G/T di Klotho influenza la risposta alla dieta iposodica: i pazienti portatori dell’allele G presentano una riduzione della PA significativamente inferiore rispetto ai TT dopo 15 giorni di restrizione sodica.(figura 5)

Conclusioni

Questi risultati costituiscono la prima dimostrazione del ruolo di Klotho nella sodio-sensibilià nell’uomo.

I pazienti con valori più bassi di Klotho (corretti per l’età) sono più sodio-sensibili, cioè si comportano come se il rene fosse più anziano.

Allo stesso modo, i pazienti portatori dell’allele G dello SNP G/T di Klotho presentano un maggiore aumento pressorio dopo carico salino acuto e una minore ridouzone della Pressione arteriosa dopo riduzione del sale nella dieta.

Tale comportamento è imputabile a incapacità di modulare l’eliminazione del sodio oppure incapacità di accomodarne il volume nel letto vascolare attraverso meccanismi compensatori vascolari.

Il ruolo dei ridotti valori circolanti di Klotho potrebbe essere la riduzione del suo ruolo anti-infiammatorio nel rene come dimostrato nel modello sperimentale (Zhou 2015 [2]).

Quindi, la riduzione di Klotho circolante (su base genetica o fisiologica dovuta all’età) comporta una maggiore sensibilità al sale e quindi un invecchiamento precoce del rene.

Limite del nostro studio è la bassa frequenza dell’allele G, che non ci ha permesso di valutare fino ad ora la differenza di valori circolanti di Klotho in base ai genotipi.

Metodi

Tecniche di genotipizzazione: La maggior parte dei campioni sono stati genotipizzati con tecnica Whole Genome genotyping (Illumina 1M chip); il completamento della casistica è stato fatto con metodica TaqMan SNP Assays (ThermoFisher).

Dosaggio Klotho sierico: ELISA Assay Kit IBL 27998.

Analisi Statistica: Haploview per strategia di tagging (r²=0.80); General Linear Model/ANOVA per associazioni genetiche con variazioni della PA; Chi squared analysis per confronto tra sodio sensibile e sodio resistenti.