Proteomica e biocompatibilità delle membrane per emodialisi

Introduzione

La bio(in)compatibilità delle membrane emodialitiche, riferita alle potenziali conseguenze del contatto fra sangue e dializzatore, è uno dei fattori favorenti le complicanze del trattamento emodialitico [Mares J Kidney Int.2009 [1]]. L’adsorbimento proteico riduce la capacità di rimozione della membrana e risulta fondamentale per la sua biocompatibilità. Mentre vi sono ampi dati circa gli effetti sistemici dell’interazione sangue-membrana, i substrati molecolari coinvolti rimangono ad oggi poco conosciuti. Studi recenti dimostrano coma la proteomica sia un utile strumento nell’investigare le proteine adsorbite sulle membrane emodialitiche [Mares J Kidney Int.2009 [1]Bonomini M J.Proteome Res.2006 [2]Urbani A J.Blood Transfus.2012 [3] (full text)]. Nel nostro studio esaminiamo la capacità di adsorbimento proteico ed il profilo coagulativo della membrana Helixone (HE) versus il triacetato di cellulosa (CTA). I risultati evidenziano una modulazione della cascata coagulativa, in particolare del pathway del collagene delle piastrine attivate, principalmente in relazione alla tipologia di membrana considerata.

Metodo

Abbiamo esaminato e comparato il pattern di adsorbimento proteico ed il profilo coagulativo di due differenti membrane per emodialisi: il CTA, membrana cellulosica modificata e l’Helixone, membrana sintetica ad alto flusso. Analisi di proteomica sono state eseguite sull’eluato di tre pazienti non-diabetici in regolare trattamento emodialitico ed in regime anticoagulativo stabilizzato con eparina a basso peso molecolare. I parametri coagulativi (PT, PTT, fibrinogeno) sono stati valutati all’inizio ed al termine della seduta dialitica. L’aggregazione piastrinica è stata invece valutata per mezzo del TRAPtest, stimolazione piastrinica mediata dalla cascata del recettore della trombina (TRAP-6), e del COLtest, aggregazione indotta dal collagene. Antagonista del complesso GpIIb/IIIa è stato utilizzato come controllo negativo.

Risultati

Abbiamo analizzato la biocompatibilità dellle membrane CTA ed HE mediante indagini di proteomica caratterizzate da una combinazione di cromatografia liquida ad alta prestazione e spettrometria di massa [Pieroni L Mol Bio Syst 2011 [4]Alberio T Mol Bios 2014 [5]](Shotgun proteomics) al fine di comparare i differenti profili di adsorbimento proteico al termine della seduta dialitica. Come evidenziato in nostri precedenti studi [A.Urbani Mol.BioSyst 2012 [6], Urbani A J.Blood Transfus 2012 [3] (full text)], la maggior parte delle proteine adsorbite dal CTA provengono dalla componente extracellulare, essendo rappresentate da un tasso elevato di proteine plasmatiche quali catene immunoglobuliniche, albumina, apolipoproteine o fattori del complemento, mentre la membrana HE trattiene una scarsa quantità di proteine plasmatiche afferenti a complessi macromolecolari ed al comparto extracellulare (Figura 1). Il set di dati è stato poi inserito nel sistema QIAGEN’s Ingenuity Pathway Analysis (IPAs) per l’effettuazione di analisi sui network cellulari coinvolti. Sulla base di esperimenti quantificativi ed analisi IPA abbiamo selezionato una serie di proteine successivamente validate attraverso indagini di spettrometria di massa tandem (MS/MS). Questi dati confermano l’adsorbimento da parte del dializzatore HE di proteine associate con la cascata coagulativa (Figura 2), suggerendo un possibile ruolo attivo di questo materiale nella modulazione di take network molecolare (Figura 3). L’utilizzo della membrana CTA invece non ha mostrato influenze significative su tale sistema biomolecolare ed il trattamento dialitico non determina alterazioni del rapporto fibrinogeno/PTT (Figura 4). Per quanto riguarda l’Helixone non si sono evidenziate differenze significative in termini statistici nei singoli parametri sebbene abbiamo rilevato una lieve differenza di concentrazione del fibrinogeno come gia riportato in precedenza [Urbani A Mol BioSyst 2012 [6]].

Discussione

La deposizione di un film proteico su una membrana esterna è un passaggio critico per eventi successivi quali l’attivazione leucocitaria e della cascata coagulativa o la modificazione di proteine plasmatiche. Pertanto l’identificazione delle proteine adsorbite è di cruciale importanza per la valutazione della biocompatibilità in vivo dei biomateriali. La proteomica si è dimostrata una metodica molto efficiente nel campo di ricerca relativo alla terapia sostitutiva renale [M.Bonomini J.Nephrol 2012 [7],V.Thongboonkerd J.Proteomics 2010 [8]] come confermato anche dai nostri dati. In questo studio,oltre a confermare le nostre precedenti osservazioni circa l’adsorbimento da parte del CTA di proteine solubili e del polisulfone di fibrinogeno e componenti del complemento, abbiamo anche ampliato lo spettro di proteine rilevabili attraverso misurazioni MRM (multiple reaction monitoring). In aggiunta, le proteine adsorbite dal CTA, tra le quali RTB4, risultano correlate al pathway di attivazione del complesso LXR/RXR, confermando il coinvolgimento nel metabolismo lipidico e nel trasporto cellulare. Per Helixone abbiamo invece evidenziato una correlazione del film proteico con il signalling del VEGF e dell’integrina. La ritenzione determinata dall’HE su proteine collegate con la cascata coagulativa suggerisce, in linea con recenti osservazioni [A.Urbani Mol.BioSyst [6]. A.Urbani J.Blood Transfus 2012 [3] (full text),T.Kuragano Blood Purif 2003 [9],F.Olafiranye Case Rep.Med 2011 [10] (full text)], un ruolo centrale di questa membrana nella modulazione di tale processo. Infine, abbiamo rilevato un incremento di proteine del sistema coagulativo attraverso un’analisi SRM (selected reaction monitoring) sulle proteine adese ad entrambi i biomateriali. La presenza di frammenti del fibrinogeno segnala in aggiunta la presenza di attività proteolitica [A.Urbani J Blood Transfus 2012 [3] (full text)].

Conclusioni

L’identificazione del layer proteico adsorbito sulla membrana dialitica può fornire significative indicazioni sulle reazioni generantesi durante la procedura emodialitica. Abbiamo evidenziato come la proteomica sia in grado di fornire informazioni di carattere molecolare/biomolecolare sul film proteico adsorbito. Ulteriori informazioni circa l’impatto del biomateriale in vivo potranno condurre allo sviluppo di polimeri maggiormente biocompatibili determinando un notevole beneficio sul quadro uremico/infiammatorio caratterizzante il paziente in emodialisi.