Introduzione
L’adiponectina (ADPN), sintetizzata e secreta prevalentemente dagli adipociti, circola sotto forma di differenti isoforme [1] (full text), alcune responsabili degli effetti anti o pro-infiammatori che essa esercita nei vari tipi cellulari [2]. Alcuni studi dimostrano che l‘rh-ADPN ottenuta da mammiferi, che verosimilmente rispecchia la struttura e la funzione di quella endogena umana, in vitro induce la produzione di chemochine e citochine pro-infiammatorie [3] (full text). Al contrario, l’uso in vitro di rh-ADPN ottenuta da batteri, ovvero la forma full-lenght e quella globulare, determina effetti antiinfiammatori. Pertanto è verosimile che l’effetto biologico dell’ ADPN sia isoforma-specifico oltre che cellula-specifico. Altrettanto dibattuto è il ruolo che l’ADPN circolante e/o quella prodotta in loco dai monociti infiltrati, esercita nel danno renale [4] [5] [6]. Recentemente abbiamo dimostrato che le cellule del tubulo prossimale renale, HK-2, esprimono e secernono ADPN i cui livelli aumentano sotto stimolo infiammatorio con LPS [7]. Pertanto in questo lavoro abbiamo indagato il ruolo pro o anti-infiammatorio che l’ADPN prodotta dalle cellule renali durante lo stimolo con LPS esercita del danno infiammatorio e i meccanismo molecolari implicati.
Materiali e Metodi
Cellule tubulari renali umane, HK-2; western blot in condizioni denaturanti e non, co-immunoprecipitazione, qPCR, silenziamento genico (siRNAi), trasfezioni transienti.
Risultati
nelle HK-2 il trattamento con LPS aumenta l’espressione proteica dell’ADPN (Fig. 1A). Nelle cellule trattate con LPS (10µg/ml) l’aumento dell’espressione genica delle citochine TNFα, MCP-1 ed IL-6, risulta reversata dopo silenziamento del gene dell’ADPN (ADPN-KO). Analogalmente, l’attivazione del pathway a valle dell’ADIPOR1 LPS-indotto, pAMPK, pERK, pJNK, risulta abrogata in cellule ADPN-KO (Fig. 1B). Saggi di WB effettuati su estratti citosolici e nucleari di cellule trattate con LPS mostrano un aumento della traslocazione nucleare del fattore di trascrizione NFkB, reversata in HK-2 ADPN-KO (Fig. 2A). Nelle medesime condizioni sperimentali abbiamo dimostrato che l’aumento della espressione proteica della chinasi IKK e dell’inibitore di NFkB, pIKB, a cui consegue la traslocazione nucleare di NFkB, è abrogata in HK2 ADPN-KO (Fig. 2B). Questi risultati sono stati confermati tramite saggio di co-IP (Fig.2C). Inoltre il trattamento con LPS aumenta la fosforilazione di pcJun e pcFos che dimerizzando formano il complesso AP-1. Tale effetto risulta reversato in cellule ADPN-KO (Fig. 2D). Saggi di trasfezione transiente effettuati trasfettando le HK2 con il promoter wt del TNFα, dimostrano un aumento trascrizionale del promoter LPS-indotto (Fig. 3A) parzialmente reversato in cellule pretrattate con l’inibitore di AP-1 (UO126) o dell’NFkB (Partenolide) (Fig. 3B). Il pretrattamento combinato con entrambi gli inibitori abroga l’attività trascrizionale del promotore LPS-indotta (Fig. 3C). Infine, tramite saggi di WB effettuati in condizioni non denaturanti, abbiamo dimostrato che le HK-2 esprimono e secernono sia basalmente che sotto stimolo con LPS tutte e tre le isoforme dell’ADPN, sebbene quella a basso peso molecolare (low-ADPN) risulta essere maggiormente rappresentata (Fig. 4A).
Conclusioni
I nostri dati dimostrano che l’ADPN secreta dalle cellule tubulari renali è direttamente coinvolta nei meccanismi molecolari che mediano il danno infiammatorio LPS-indotto.
