I LIVELLI CIRCOLANTI DI suPAR E OSTEOPONTINA NELLA NEFRITE LUPICA: BIOMARKERS PRECOCI DI DANNO RENALE?{-}

INTRODUZIONE

• Osteopontina (OPN) e il recettore solubile di tipo urokinasico dell’attivatore del plasminogeno (suPAR) – due citochine pleoiotropiche coinvolte in vari meccanismi dell’immunità e della flogosi – sono state proposte come markers di attività infiammatoria in malattie autoimmuni tra cui il LES e nella sepsi (Kaleta B 2014 [1]; Reichsoellner M 2014 [2]).

• I livelli sierici di entrambe sono stati associati allo presenza di proteinuria nella nefrite lupica (Quaglia M 2014 [3]; Musetti C 2014 [4]) e suPAR è stato anche  proposto come “fattore permeabilizzante” della FSGS  (Wei C 2012 [5] (full text)

• OPN e suPAR sono funzionalmente correlate ma i fattori che ne modulano i livelli sierici non sono del tutto noti (Vaschetto R 2014) [6]. Gli ACE-I riducono i livelli sieri e tissutali di OPN  ed esercitano probabilmente anche con questo meccanismo un effetto nefroprotettivo (Wigginns KJ 2008) [7]

SCOPO DEL LAVORO

1) Analisi della correlazione tra cinetica dei livelli sierici di suPAR e comparsa di proteinuria in un modello murino di nefrite lupica.

2) Analisi della correlazione tra livelli di OPN e secrezione monocitaria di suPAR in un modello “in vitro”

3) Analisi dell’effetto della terapia con ACE-I sulla secrezione monocitaria di suPAR

MATERIALI E METODI

Saggi ex-vivo su topi MLR/lpr. Il sangue è stato prelevato mediante prelievo retro-oculare su topi MLR/lpr, che costituiscono un modello murino di LES. Questa tecnica consente di mantenere l’animale in vita, permettendo così di fare prelievi multipli nel tempo. Il sangue è stato poi centrifugato a 7000 rpm per 17minuti ed il siero raccolto e conservato -20°C. Il saggio ELISA murino anti-uPAR solubile (R&D) è stato utilizzato per testare i diversi campioni.I campioni di urina, raccolti negli medesimi punti temporali, sono stati invece testati a fresco, mediante specifiche strip in grado di rilevare i livelli di proteinuria.

Saggi in vitro. Monociti, purificati dal sangue intero di donatori sani, sono stati matenuti in coltura (106 cellule) in terreno RPMI1640 + 10% siero fetale bovino e stimolati o meno con osteopontina ricombinante commerciale (rhOPN, R&D) per 6h, 16h e 24h. In ognuno di questi punti temporali sono state raccolti il surnatante di coltura e le cellule. E’ stata testata la concentrazione di suPAR, mediante saggio ELISA (R&D), nel surnatante di coltura. Le cellule invece sono state utilizzate per valutare l’espressione in membrana ed i livelli trascrizionali del recettore uPAR rispettivamente mediante citofluorimetria a flusso e Real-time PCR. Infine i monociti sono stati attivati con lipopolisaccaride (LPS, Sigma) [1ug/mL] per 24h e quindi esposti all’ACE-inibitore Captopril.  Il surnatante di coltura e le cellule sono state collezionate per analizzare la concentrazione di uPAR solubile e la sua espressione in membrana dopo esposizione a ciascuna delle due molecole.

RISULTATI

L’analisi della correlazione tra cinetica dei livelli sierici di suPAR e comparsa di proteinuria in un modello murino di nefrite lupica ha evidenziato che l’incremento dei livelli di suPAR precede la comparsa di proteinuria (Fig1).

La stimolazione di una coltura di cellule monocitarie con OPN ricombinante (rhOPN) determina precocemente un aumento dell’espressione dell’mRNA di uPAR (Fig 2). La somministrazione di OPN determina inoltre una riduzione dell’espressione di uPAR sulla plasmamembrana monocitaria ed un aumento dei livelli di suPAR nel surnatante (Fig 3). Per contro la somministrazione di un ACE-inibitore (Captopril) determina un aumento dell’espressione di uPAR sulla plasmamembrana monocitaria ed una riduzione dei livelli di suPAR nel surnatante dopo che il monocita è stato attivato con LPS (Fig 4).

DISCUSSIONE

Questi dati preliminari suggeriscono che suPAR possa essere un mediatore di podocitopatia in un modello murino di nefrite lupica, in accordo con le evidenze clinico-sperimentali nel contesto della FSGS, poiché elevati livelli circolanti precedono la comparsa di proteinuria. Resta da chiarire la natura del rapporto tra livelli di suPAR e proteinuria (biomarker o effettivo mediatore di danno renale?) e la sua specificità in relazione al tipo di glomerulonefrite (Musetti C 2014 [4]).

I livelli circolanti di suPAR sembrano correlati a quelli di OPN, che è in grado aumentare la produzione monocitaria di suPAR sia aumentando precocemente l’espressione genica di uPAR, sia favorendone lo “shedding” dalla superficie cellulare, con conseguente aumento dei livelli di suPAR circolante (Fig. 5)

L’ACE-inibitore appare in grado di inibire entrambi questi effetti quando somministrato a monociti precedentemente attivati da LPS. La riduzione dei livelli circolanti di OPN, insieme a questi effetti sulla secrezione monocitaria di suPAR, possono rappresentare meccanismi importanti attraverso i quali il farmaco esercita il suo effetto anti-proteinurico e nefroprotettivo.

CONCLUSIONI

In conclusione, livelli circolanti elevati di suPAR precedono lo sviluppo di proteinuria in un modello sperimentale murino di nefrite lupica e la secrezione monocitaria di questa citochina è aumentata da OPN e ridotta dall’ACE-inibitore Captopril. Sia suPAR che OPN appaiono quindi coinvolti nell’eziopatogenesi della nefrite lupica e sono promettenti sia come biomarkers che come potenziali targets terapeutici.