Diagnostica molecolare della malattia policistica renale recessiva mediante Next-Generation Sequencing

INTRODUZIONE

La malattia policistica renale autosomica recessiva (Autosomal Recessive Polycystics Kidney Diesease – ARPKD) è una ciliopatia rara, ad esordio principalmente perinatale o infantile, caratterizzata dallo sviluppo di cisti multiple nei reni, nel fegato e spesso in altri organi [1]. La patologia è causata da alterazioni genetiche a carico del gene PKHD1 (chr16p13.3) un gene di ˜500 kb, formato da 67 esoni e caratterizzato da un complesso pathway di splicing alternativo [2] (full text). Il gene codifica per la Fibrocistina 1, una proteina ciliare, implicata nei processi di differenziamento, controllo della proliferazione e determinazione della polarità cellulare [3] (full text) [4] (full text) [5] (full text).

Le dimensioni del gene e la mancanza di hotspots mutazionali rendono la diagnostica molecolare laboriosa e costosa con le tecniche convenzionali.

SCOPO

Lo scopo del presente studio è stato quello di sviluppare e validare un test per l’analisi molecolare del gene PKHD1 basato sull’impiego di tecnologie di Next-Generation Sequencing (NGS), in particolare sull’utilizzo della piattaforma Ion Torrent PGM.

CASISTICA E METODI

Casistica. Il protocollo NGS è stato validato retrospettivamente su una coorte di 13 pazienti con diagnosi molecolare nota, ottenuta con sequenziamento tradizionale, e prospetticamente su 10 pazienti con fenotipo clinico di ARPKD o portatori obbligati. 

Metodo. Il disegno sperimentale per l’analisi del gene PKHD1, ottimizzato per la piattaforma Ion Torrent PGM, è stato ottenuto mediante l’utilizzo del software AmpliSeq Ion Designer al quale è stata sottomessa l’intera regione codificante il gene oltre che 15-20bp fiancheggianti gli esoni, per consentire l’indagine molecolare anche dei siti di splicing. Il software ha fornito come output il disegno complessivo di 122 ampliconi parzialmente sovrapposti, per la simultanea amplificazione teorica di 12.245 kb corrispondenti al 99,88% della regione target in due sole multiplex-PCR. Questo approccio ha consentito di ottenere delle librerie genomiche partendo da soli 10ng di DNA per paziente. Le regioni “non coperte” dal disegno sperimentale così come tutte le varianti trovate con il protocollo NGS sono state sequenziate in Sanger.

Analisi dei dati. L’analisi delle varianti è stata effettuata mediante l’utilizzo del software Ion Reporter utilizzando i plug-in Variant Caller ed Ingenuity. Tutte le varianti esoniche nonsenso, frameshift e le varianti nei siti di splicing canonico sono state considerate patogeniche. Per tutte le varianti missenso trovate, sono stati consultati i database che raccolgono le mutazioni genetiche associate al fenotipo clinico: HGMD (Human Gene Mutation Database) e Humgen (http://www.humgen.rwth-aachen.de). Per tutte le missenso non descritte in letteratura come associate all’ARPKD, aventi un MAF (Minor Allele Frequence)< 0.05, sono state eseguite le predizioni di patogenicità utilizzando 3 diversi tools bioinformatici disponibili online: PolyPhen 2.0, SIFT ed HOPE. Per tutte le varianti nei siti di splicing non canonici, mai descritte, sono stati consultati 3 diversi tools bioinformatici di predizione quali ESE finder, RESCUE-ESE e BDGP.

RISULTATI

Il sequenziamento simultaneo di 8 pazienti per run, univocamente barcodati, ha permesso di ottenere una copertura media del target del 99,83%, con il 99.31% delle basi lette almeno 100X. Complessivamente, sono state richiamate 67 varianti, da queste, l’analisi dei dati ha permesso di identificate 29 varianti potenzialmente causative, 16 delle quali sono risultate novel.

Nei 13 pazienti a mutazione nota tutte le mutazioni sono state correttamente individuate in più, 4 casi, è stato possibile identificare varianti aggiuntive che non erano state diagnosticate con il metodo convenzionale (Figura 1): 4 di queste mutazioni risultavano già descritte in letteratura e associate al fenotipo clinico ARPKD, mentre 2 risultavano novel

Nei pazienti con fenotipo ARPKD o portatori obbligati, il test, ha permesso la completa caratterizzazione molecolare del gene PKHD1 per 9 dei 10 pazienti sottoposti al protocollo (Figura 2) ed ha consentito di eseguire una diagnosi prenatale in meno di una settimana (Figura 3).

CONCLUSIONI

Questo metodo è risultato accurato, robusto e più sensibile del sequenziamento convenzionale ed ha consentito di esegure delle diagnosi molecolari in tempi brevi e con costi notevolmente ridotti.