Razionale
Tra i diversi calcoli renali quelli “molli” o “di matrice” sono molto rari (Stoller Ml – 1994 [1]) (Boonla – 2014) [2]. Essi sono costituiti da una sostanza mucosa, elastica, amorfa e radiolucente per la scarsa se non nulla componente minerale (Shah – 2009 [3]). Allo scopo di comprenderne la patogenesi abbiamo identificato le proteine che li compongono con un’analisi del profilo proteomico di 5 calcoli avvalendoci di due diversi approcci proteomici complementari: top-down and bottom-up (Scherl A – 2015 [4]).
Casistica e metodi
Con la collaborazione di centri a Padova, Londra e Dubai sono stati individuati 4 pazienti dai quali sono stati rimossi chirurgicamente 5 calcoli (una paz ha fornito 2 calcoli in tempi diversi).
Nella strategia top-down le proteine sono state estratte dai calcoli con una soluzione acidica/aceto nitrile, separate e analizzate come proteine e peptidi non denaturati utilizzando una colonna C8 HPLC accoppiata ad uno strumento ESI-LTQ-Orbitrap-tandem mass spectrometry (MS/MS).
Nell’approccio bottom-up i campioni sono stati trattati con un tampone fortemente denaturante per omogeneizzarli e sonicarli. Dopo separazione con SDS-PAGE monodimensionale e tripsinizzazione i campioni erano analizzati in cromatografia liquida C18 e con ESI-LTQ-Orbitrap MS/MS.
Sono state inoltre condotte indagini di istopatologia e immunoistochimica su tessuto renale ottenuto da uno dei pazienti.
Risultati
Nei 5 campioni sono state complessivamente identificate 142 proteine e peptidi non ridondanti.
Tra queste la defensina 1 neutrofilica, e le proteine S100-A8 and S100-A9 costituivano la componete principale di questi calcoli. Anche importante era la presenza di timosina beta-4, le proteoforme eterodimeriche, troncate, ossidate, fosforilate e acetilate di S100-A8/S100-A9, nonché granuline, e ubiquitina.
Le indagini istopatologiche su tessuto renale hanno confermato la presenza di infiammazione, con presenza di linfociti T CD3+ e linfociti B CD20+ nell’interstizio renale. Lo studio immunoistochimico ha confermato la presenza di calgranulina A e B (Figure 1, 2, 3, 4, 5).
Conclusioni
I due diversi approcci proteomici ha permeso l’identificazione di proteine e le loro forme modificate post-translazionalmente consentendo di comprendere la composizione e l’origine di questi calcoli. La notevole rappresentazione di molecole infiammatorie suggerisce che un processo infiammatorio sia l’evento iniziale nella formazione dei calcoli molli e non la sua conseguenza. Inoltre, le modificazioni post-translazionali di S100-A8 e A9 nonché la presenza di timosina beta-4, granuline, ubiquitina depongono per l’intervento della immunità innata e di una vigorosa risposta contro-infiammatoria.