Obiettivo
Il dosaggio del p-Cresolo Solfato (pCS) nei campioni biologici può rappresentare un valore predittivo per determinare complicazioni cardiovascolari che possono insorgere durante il trattamento emodialitico (R. Vanholder 1999 [1] (full text) , B.K. Meijers, 2008 [2]). L’obiettivo di questo studio è di valutare l’utilizzabilità della tecnica Multiple Reaction Monitoring (MRM) al fine di migliorare la sensibilità e la selettività della identificazione del pCS in piccole quantità di plasma dei pazienti uremici (N.R. Kitteringham, 2009 [3]).
Materiali e Metodi
A trenta µL di plasma di pazienti uremici è stato aggiunto uno standard interno (IS) per valutare eventuali perdite di pCS durante la preparazione e l’analisi del campione. Dopo la deproteinizzazione con Metanolo (1:4 v/v), il supernatante è stato concentrato e risospeso nella fase mobile dell’ HPLC. Un µL di campione deproteinizzato è stato quantificato usando un HPLC accoppiato alla spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS) su triplo-quadrupolo (Figura A).
Un dosaggio di pCS altamente sensibile e selettivo è stato ottenuto attraverso la selezione specifica dello ione parentale (m/z 187) e monitorando I due frammenti ionici figli (m/z 80.00 e 107.00). Sono state applicate diverse curve di calibrazione: la calibrazione esterna (EC) è stata effettuata usando soluzioni standard di pCS, la calibrazione con le aggiunte standard (AC), ottenuta aggiungendo diverse concentrazioni di pCS standard nel campione e la calibrazione Youden (YC) realizzata incrementando il volume del campione.
Risultati
Un picco ben risolto per il pCS è stato ottenuto 2 min dopo l’iniezione del campione. L’analisi è stata effettuata usando la tecnica MRM monitorando le seguenti transizioni: m/z 187 → 80.00 e m/z 187 → 107.00 per il pCS (Figura B). Tutte le curve di calibrazione hanno mostrato un eccellente linearità. Il confronto tra la pendenza e l’intercetta per i diversi tipi di calibrazioni hanno indicato la presenza di un effetto matrice. La curva di calibrazione empirica denominata Matrix-Corrected Calibration (MCC) è ottenuta dai parametri di regressione delle curve YC- e AC- ed è stata utilizzata per correggere l’effetto della matrice sulla quantificazione del pCS (L. Cuadros-Rodriguez, 2007 [4]).
Il metodo di analisi mostra una buona precisione nella stessa giornata, compresa tra 0.21 e 4.57%, ed un ottima ripetibilità, valutata in diverse giornate, compresa tra 1.63 e 6.67%. La percentuale di recovery ottenuta per soluzioni a diverse concentrazioni di pCS è compresa tra 100% e 107%, indicando un ottima accuratezza e selettività del test.
Conclusioni
L’approccio MRM si è rivelato altamente sensibile e selettivo, esso mostra inoltre un’eccellente ripetibilità. Il metodo sviluppato richiede un ridotto volume di campione, un tempo di analisi molto breve e una metodica di preparazione semplice (Cuoghi A. 2012 [5]).
Lo sviluppo di un metodo sensibile e accurato per la quantificazione del pCS nel plasma è molto importante in medicina clinica per predire l’insorgenza di complicazioni cardiovascolari nel pazienti emodialitici.