MUTAZIONI DI WT1 IDENTIFICATE IN UNA COORTE DI PAZIENTI TRAPIANTATI DI RENE PER SINDROME NEFROSICA CORTICORESISTENTE

INTRODUZIONE

Il gene WT1 (Wilms tumor-suppressor gene-1), codifica per un fattore di trascrizione, che gioca un ruolo critico durante lo sviluppo renale e gonadico. WT1 svolge inoltre un’importante funzione nel mantenimento dello stato differenziativo del podocita durante la vita adulta. Questo gene mappa sul Chr 11p13, è costituito da 10 esoni e codifica per una proteina che presenta 4 domini zinc-finger (ZF1, 2, 3 e 4), ad elevata affinità per il DNA, ed una regione N-terminale ricca in residui di prolina e glutammina (FIG. 1). Sono state identificate 4 isoforme proteiche dovute allo splicing alternativo dell’esone 5 e all’inclusione o esclusione di 3 aminoacidi (K-T-S), in seguito alla ritenzione dell’introne 9. Queste isoforme, espresse durante la nefrogenesi e nella vita adulta, hanno affinità differenti per il DNA e diverse localizzazioni nucleari.

Mutazioni costituzionali del gene WT1 si associano alla Sindrome di Denys-Drash (DDS) e alla Sindrome di Frasier (FS). La DDS è una patologia caratterizzata da un quadro istologico di sclerosi mesangiale diffusa (DMS), insufficienza renale ad esordio precoce, anomalie dei genitali e alto rischio di sviluppare tumore di Wilms. La FS è invece caratterizzata da un quadro istologico di glomerulosclerosi focale segmentale (FSGS), insufficienza renale ad esordio tardivo, pseudoermafroditismo maschile e gonadoblastoma.

  • Nei pazienti con DDS le mutazioni sono localizzate principalmente negli esoni 8 e 9 (hot spot mutazionali) che codificano per i domini ZF2 e ZF3
  • Nei pazienti con FS le mutazioni riguardano quasi esclusivamente il sito di splicing alternativo nell’introne 9 (hot spot mutazionale)

La DDS e la FS sembrano tuttavia rappresentare le due estremità di uno spettro di alterazioni le cui caratteristiche cliniche e molecolari possono sovrapporsi (McTaggart SJ et al – 2001 [1]).

In letteratura sono state riportate mutazioni di WT1 anche in casi isolati di DMS o FSGS (Takata A. et al – 2000 [2] (full text), Janpierre C. et al – 1998 [3], Schumacher V. et al – 1998 [4] (full text)). Una mutazione di WT1 è stata descritta anche in un paziente con sola proteinuria all’esordio (Benetti et al.- 2010 [5] (full text)).

MATERIALI E METODI

Abbiamo eseguito l’analisi molecolare del gene WT1, in modo retrospettivo, su una coorte storica di 22 pazienti sottoposti a trapianto di rene, presso l’ U.O. di Nefrologia Pediatrica, Dialisi e Trapianto del Dipartimento di Salute della Donna e del Bambino di Padova, in seguito a insufficienza renale terminale secondaria a sindrome nefrosica e non sottoposti precedentemente a studi molecolari.

L’analisi mutazionale è stata effettuata mediante HRM (high resolution melting) su DNA estratto da sangue periferico. I primer sono stati posizionati almeno 100 bp al 5’ e al 3’ della regione codificante del gene. In tutti i casi con curva di melt diversa da quella dei genotipi di riferimento (DNA wild type) è stato condotto il sequenziamento diretto.

RISULTATI E DISCUSSIONE

Sono state evidenziate due mutazioni missense in 4 dei 22 pazienti analizzati.

La Mutazione NM_024426.4 c.988T>C si localizza nell’esone 7 (FIG. 2) ed è stata riscontrata in una paziente femmina che aveva presentato esordio di sindrome nefrosica nel primo anno di vita ed era pertanto stata sottoposta a biopsia renale, con referto istologico di FSGS. La paziente non presentava alcuna patologia extrarenale associata alla sindrome nefrosica. Questa mutazione, mai riportata precedentemente in letteratura, porta alla sostituzione di un aminoacido neutro/polare con uno basico (Cys330Arg) nel dominio ZF1. L’analisi bioinformatica con PoliPhen2 e SIFT conferma la patogenicità di tale mutazione dovuta probabilmente alla distruzione del sito di legame con il DNA. La mutazione non era presente nella nostra popolazione di controllo, costituita da 100 campioni di DNA da sangue di cordone ombelicale.

La Mutazione NM_024426.4 c.1180C>T si localizza nell’esone 9 (FIG. 3) ed è stata riscontrata in 3 pazienti (due femmine e un maschio) che avevano avuto esordio di sindrome nefrosica dopo il primo anno di vita. La biopsia renale eseguita per sindrome nefrosica cortico-resistente, ha evidenziato in 2 pazienti un quadro istologico di FSGS ed in 1 paziente di DMS. Non erano presenti patologie extrarenali in associazione alla sindrome nefrosica, tranne criptorchidismo bilaterale nel paziente  maschio con FSGS.

Questa mutazione che porta alla sostituzione di un AA basico con uno idrofobico (Arg394Trp) nel dominio ZF3, è stata spesso riportata in associazione alla DDS (Little M. et al 1997)

Nessuno dei 4 pazienti ha sviluppato neoplasia nel corso del follow up.

CONCLUSIONI

Questi risultati confermano l’ampia variabilità fenotipica associata alle mutazioni di WT1 (LipsKa B.S. et al, Pediatr. Nephrol. (2012) 27:1605–1829. ESPN 6-8 settembre 2012 Cracovia). Come già suggerito dai dati della letteratura, la DDS e la FS dovrebbero essere considerate come parte di un ampio spettro di malattie causato da mutazioni del gene WT1, piuttosto che sindromi separate. Infatti la stessa mutazione è stata da noi identificata in pazienti non sindromici, che presentavano quadri istologici di FSGS o di DMS. L’identificazione in una nostra paziente, di una nuova mutazione di WT1 nell’ esone codificante per il dominio ZF1, non considerato hot spot mutazionale, conferma una possibile sottostima delle alterazioni di questo gene in soggetti con sindrome nefrosica isolata. Suggeriamo pertanto di estendere lo screening mutazionale di WT1 a tutti i pazienti con quadro istologico di DMS e di FSGS non sindromico e di includere l’analisi dell’esone 7.